崇禎十二年，李自成經過三年的準備和恢復，再次舉兵攻明。轉戰陜甘、河南一帶，在河南李自成斬殺明朝的萬安王。與當地農民軍首領順利會師，部眾發展到數十萬人之多。后李自成率軍連戰連捷，攻克宜陽，取得盧氏。李自成在轉戰的過程中，先后有許多有知識的人加入，如對李自成產生了重要影響的牛金星、李巖等人就是在這一時期加入李自成的起義軍的，并很快成為心腹謀士。后來李自成采納李巖的建議提出了“均田免糧”的口號，“迎闖王，不納糧”，李自成的起義軍得到勞苦大眾的一致擁護。崇禎十四年春，李自成在城內守軍的策應下攻陷洛陽，殺死了民憤極大的福王朱常洵。不久李自成又率軍圍開封，數攻不克，轉戰鄧州，擊殺明朝總督傅宗龍。崇禎十五年，李自成與羅汝才以20萬的部隊再圍開封，激戰20余日未能攻克，但卻回師攻破河南襄城，俘斬明總督汪喬年和降明的農民軍首領李萬慶。繼而攻克陳州，與當地農民軍會合，返師第三次圍開封。先殲滅出城突襲的三營明軍，后連破鄭州、滎陽、上蔡，掃清開封周圍明軍據點。明督師丁啟睿、總兵左良玉率師十余萬挺進朱仙鎮。李自成以部分兵力繼續圍城，率主力占領朱仙鎮有利地形迎擊明軍，獲得大勝，俘虜明軍數萬人。崇禎十六年正月，李自成攻克襄陽，提出了“三年不征，一民不殺”口號，李自成被擁為奉天倡義文武大元帥。隨后，李自成采納謀士顧君恩計策，制定先取關中、再攻山西、后取北京的作戰方略。親自率大軍北上河南，在汝州之戰中殲滅明軍4萬余人，迫使孫傳庭敗逃陜西。乘勢追擊，盡殲鎮守潼關的明軍，擊殺孫傳庭，占領潼關、西安等地。隨即分兵追殲明軍殘部，連下延安、漢中、榆林諸重鎮。

崇禎十七年正月，李自成建立大順政權，年號永昌，李自成稱大順王，改西安為西京。隨后李自成率軍強渡黃河，攻進山西境內，攻克太原。然后，李自成兵分兩路，一部由大將劉芳亮率領攻河北，自己同大將劉宗敏率主力部隊北上寧武關，從北面迂回圍攻北京，李自成率領大軍順利攻下大同、宣府、昌平。于三月十七日攻到北京城下，此時，明朝的崇禎皇帝已經無軍可調，守城的都是一些老弱病殘的兵士。崇禎急調山海關總兵吳三桂和江南明軍率兵勤王。但是已經為時已晚，三月十九日，李自成率軍攻破了北京城，崇禎帝朱由檢在萬念俱灰，自縊于煤山之上。

李自成在攻陷北京之后，開始被勝利沖昏了頭腦。這些農民出身的起義軍將領以為攻陷了北京，除掉了明朝的皇帝，就是大功告成，可以坐享天下了。李自成和劉宗敏等人也都開始忙于修建宮室，搜羅美女，對明朝的官員進行追贓。他們沒有及時的追剿依然據有江南的幾十萬明軍，也忽視了重兵在握的山海關總兵吳三桂。起初的時候，李自成還想招降吳三桂。但是，由于義軍將領在追贓的過程中，致使吳三桂的父親吳襄自殺殉國，更讓他不能忍受的是，自己心愛的寵妾陳圓圓也被義軍大將劉宗敏搶了過去。吳三桂一怒之下投降了清朝的多爾袞，打開城門引兵入關。四月十三日，李自成率軍十萬討伐吳三桂。兩軍在山海關前的一片石接戰，這真是一場惡戰！只見狂風大作，飛沙走石遮蔽天日。李自成的大順軍和吳三桂的軍隊在風沙之中展開一場不辨敵手的血戰。霎時間，金鼓之聲，吶喊之聲傳到百里之外。在農民軍層層包圍之下，吳三桂率軍左沖右突，拼命死戰。雙方苦戰了大半日，到下午時分，吳三桂幾乎要支撐不住了。就在他精疲力竭，即將崩潰的時候。多爾袞的八旗鐵騎突然從亂石之間殺了出來，大順軍雖然奮勇拼殺，與清軍苦戰半日。但最終還是在兩軍的圍攻之下落敗。大將軍劉宗敏中箭負傷，損兵數萬。李自成被迫急令撤退，清軍乘勝追擊，一直追出四十多里開外，獲得許糧草騾馬無數。

山海關之戰后，李自成退回北京。由于主力遭到重大傷亡，李自成不得不作出放棄北京退守關中的戰略決策。二十九日，李自成在太和殿稱帝，第二天便率軍撤出了北京，揮師西進，據關中以抗清軍。十月，多爾袞率軍入關，順治帝定鼎燕京之后，馬上抽調八旗勁旅攻剿李自成。為了徹底消滅李自成的幾十萬大軍，多爾袞命英親王阿濟格為靖遠大將軍，率軍八萬西討李自成。旋即又命豫親王多鐸率部下精兵與之合剿。

在清軍和明朝降兵的合擊之下，李自成的大順軍節節敗退。一直退到了陜西潼關，潼關之戰，大順軍再次失利，被迫退出陜西，轉戰河南、湖北。準備奪取東南作為抗清基地，但是清軍卻對大順軍緊逼不放。派出重兵節節阻擊，南明政權的明軍也順勢攻擊大順軍。導致李自成在湖北武昌、陽新、江西九江接連失利，東下的去路也被切斷。后來，李自成率軍到達九宮山一帶，此后便失去了蹤跡。幾十萬的大順軍也像蒸發似的，一下子就沒了。關于李自成最終的結局，后人提出了許多不同的看法。

其中一種最具代表性說法是李自成在九宮山被地主團練攻殺。提出這種說法的最主要的依據是清朝靖遠大將軍阿濟格給朝廷的奏報和南明王朝駐湘將領兵部尚書何騰蛟給唐王的報告。阿濟格的奏報中稱：“李自成兵盡力盡，僅帶親信20人，竄入九宮山中，被村民圍困，無法脫逃，自縊而死。”他派人前去驗尸，而尸體已經腐爛，無法辨認。何騰蛟給唐王的報告也稱，自己的部眾將李自成斬于九宮山下，只是丟了首級。但是，這兩個說法似乎都存在許多可疑之處，令人難以盡信。因為李自成是一位“萬金之賞莫能購，十道之師莫能征”的軍事奇才，不僅驍勇異常，而且還很有謀略。他的生死對清王朝或南明王朝統治者來說都是一個很重要的問題。但在阿濟格和何騰蛟的報告都存在模糊之處。阿濟格的奏報中說李自成的尸體“尸朽莫辨”，何騰蛟的報告中則稱尸體無頭。也就是說兩位將領都沒有親自看到死得這個人就是李自成。而是根據別人的報告，臆斷這就是李自成，便急忙上了折子功請賞。特別值得一提的是，李自成退居湖湘時，手下尚有40余萬兵馬，駐九宮山一帶的至少也有數萬人，絕非奏報中所稱的僅帶20名親信。況且，如果李自成真的被殺，他的幾十萬大軍豈能善罷甘休？九宮山能平靜嗎？然而，事實上，當時九宮山很平靜，那幾十萬大軍也很平靜。也就是說，李自成遇難九宮山說，要么是兩位將領為了邀功請賞而造出來的，要么是這是李自成與其部下故意施放的煙幕彈。用李自成以死作緩兵之計。這樣一方面，可以打消南明王朝對這支大軍的敵意;另一方面，也可以緩解清軍對他的攻擊。以便可以等待時機成熟時東山再起。

另外一種比較流行的說法是，李自成沒有死，而是在夾山寺出家做了和尚。這一說法，最早見于《澧州志林》的記載，書中說李自成兵敗之后并沒有死，而是跑到了湖南的石門夾山寺出家做了和尚，法號豐天玉。后來這個人便到夾山寺探訪，寺中一位七十多歲的老和尚還記的夾山寺過去的事情，告訴他奉天玉和尚是順治初年入寺的，聲音像是西北的人。他還在寺中他親眼見過一幅李自成的畫像。1981年，在石門夾山寺發現了奉天玉大和尚墓。據考查，在一個瓷壇中盛的遺骨，與李自成身材相近。墓中陪葬物與李自成家鄉陜西米脂縣的習俗相同。此后，考古人員又在夾山寺“敕印”的石龜和“奉天玉詔”銅牌，“敕”和“詔” 字都是皇帝的專用名詞，由此可見，這個奉天玉極有可能就是做過皇帝的李自成。但對這一說法也有人持有異議。他們認為，奉天玉大和尚的墓和其他文物的發現，只能說明石門夾山寺確實有奉天玉大和尚這個人，但并不能證明奉天玉大和尚就是李自成。李自成生前左眼曾受箭傷失明，《澧州志林》中描述的李自成畫像卻雙目炯炯有神，與事實不符。李自成在夾山寺出家一說，也還有待商榷。

近來又有人對李自成的生死提出更新的說法，認為李自成兵敗后，沒有出家做和尚，也沒有在九宮山遇難，而是輾轉來到粵北樂昌的金城山。在這里繼續從事抗清斗爭，后來因叛徒出賣而受傷，死于馬背之上。當然，以上的三種說法，都各有一定道理，但都是一家之言，并非定論。事實如何，也許永遠也弄不明白。