天正10年(1582年)，織田信長消滅了甲斐的武田氏，統一天下指日可待。5月，負責中國攻略的羽柴秀吉軍面對國安蕓毛利氏40000大軍，向信長發出援兵請求。5月15日到17日之間，明智光秀負責招待長年與武田勝賴交戰的德川家康。織田信長召喚德川家康到安土城晉見，據說當時由于光秀辦事疏忽，被解除了招待的負責人職務。15日羽柴秀吉傳來求援的消息，17日織田信長命令光秀返回其屬地阪本城并準備出戰。5月26日，光秀領軍來到丹波龜山城，做好了出戰的準備。28，29日，他參拜了愛宕神社，并留下了“時在今日，天下當傾(時は今、雨が下しる、五月哉)”的名句。

天正10年(1582年)6月1日，信長援軍35000人出陣，其中包括出陣出云、石見的明智光秀軍;自己僅帶不到100人，從安土城出發，當夜織田信長下榻京都本能寺，召來國手日海和尚(即本因坊算砂)和鹿鹽利玄對弈為戲。據說此局下出了罕見的三劫連環無勝負局，包括信長在內，觀者皆驚。當日晚間，信長召來長男信忠歡宴，宴后信忠返回妙覺寺就寢。此時已有謀反之心的明智光秀回到居城和手下重臣齋藤內藏介利三、明智左馬介光春等商議，認為自己取代信長的時機已經成熟。當夜，明智軍13000余人出陣。第一隊大將明智左馬介光春四天王但馬、村上和泉、三宅式部、妻木主計3700人第二隊大將明智治左衛門藤田伝五郎、并河掃部介、伊勢與三郎、松田太郎左衛門約4000人本隊總大將明智光秀明智十郎左衛門、荒木山城守、荒木友之丞、諏訪飛騨守、齋藤內藏介、奧田宮內、御牧三左衛門3200余人天正10年(1582年)6月1日半夜，明智軍到達京都。明智左馬介光春攻織田信長泊宿的本能寺，明智治左衛門攻二條城和織田信忠泊宿的妙覺寺，明智光秀坐鎮三條堀河。本能寺更是被重重包圍，第一重四天王但馬，第二重村上和泉，第三重三宅式部;且本能寺周圍所有的出口都有2~300人負責把守。6月1日子時，明智軍完成包圍工作。聽到四周的動靜后，小姓們開始騷亂。信長最初還以為是侍衛們吵架，剛才爬起身準備斥責，(就像當初今川義元遭遇偷襲時一樣)忽聽鐵炮發射之聲，陣陣鳴響--

“定然有人反叛，去，看看叛者是誰？！”信長命令小姓森蘭丸說。森蘭丸出去了一會兒，匆匆跑回稟報：“是桔梗旗印，像是惟任日向守的部隊！”信長大驚：“光秀嗎……”“一定會失敗”蘭丸所指的，正是信長麾下大將明智光秀，他當時官位為正六位下日向守，因曾通過信長向朝廷求得“惟任”的古老姓氏，因此習慣被稱為“惟任日向守”。知道明智光秀謀反后，織田信長親自上陣，率小姓眾奮戰，但始終是寡不敵眾。御馬屋附近馬郎、藤八、巖、新六、彥一、彌六、熊、小駒若、虎若等二十四人戰死;御殿內小姓森亂、森力、森坊兄弟三人、小河愛平、高橋虎松、金森義入、菅屋角藏、魚住勝七、武田喜太郎、大冢又一郎、狩野又九郎、蒲田與五郎、今川孫二郎、落合小八郎、伊藤彥作、久々利龜、種田龜、針阿彌、飯河宮松、山田彌太郎、祖父江孫、柏原鍋兄弟、平尾久助、大冢孫三、湯淺甚介、小倉松壽等戰死。織田信長見大勢已去，切腹自殺，但奇怪的是在本能寺內竟然沒有人找到信長的尸體。信忠率本隊1500人前往救援其父失敗，于京都二條城內自殺。就是這短短兩三個小時改變了整個戰國的歷史。光秀之謀叛，普遍認為是臨時起意，策劃時間并不很長，但即便如此，以后事倒推，似乎也隱藏著許多不為當時人重視的蛛絲馬跡。

在受命西援羽柴秀吉，與毛利軍對戰后，明智光秀從安土返回自己的本城--近江坂本，五月二十六日再到丹波龜山。翌日，他前往愛宕山參拜，祈禱獲勝。二十八日，在愛宕山威德院西坊中，召來著名的連歌師里村紹巴等飲酒唱和，這就是著名的《愛宕百韻》。當時光秀所做的連歌中有一句為“ときは今天が下しる五月哉”，意為：“這細雨綿綿的五月天啊。”然而，土岐在日語中的發音正是“とき”，而明智光秀即出身于土岐氏庶流，如果“とき”確為雙關語的話，即可解釋成：“五月間，土岐氏取得了天下！”

據說連歌唱和時，光秀曾詢問里村紹巴本能寺外濠溝的深淺，紹巴回答說：“只是普通寺廟，無濠--將軍問此何意？”光秀笑笑，隨即閉口不語。但他分明在進行凝重的思索，以致于吃粽子的時候，竟然出神得忘了剝除粽葉。當晚，光秀與紹巴同榻而眠，輾轉反側，隱有嘆息聲，紹巴問他，他卻說是在思索詩句。

六月一日，明智光秀返回龜山城，在此召集麾下最親信的部將明智左馬助秀滿(光春)、明智右衛門尉光忠、藤田傅五、齋藤內藏助利三、溝口勝兵衛茂朝五人，說明自己的決心。并且直言相告：“如有異意，請斬光秀之首。”五人皆拜伏應允，并草就誓書、遞交人質以表示自己的誠心。

當日下午四時左右，明智光秀召集家中物頭，告知說：“京都的森亂(即森蘭丸)有信使來報，主公為了加強對中國地區用兵，要在京都檢閱我家的軍隊。”于是立刻整隊出發。但還有一種說法，明智軍是先西進到山崎后，光秀才宣布“閱兵”的消息，于是大軍轉向前往京都。對于明智光秀的真實意圖，普通士兵們是不了解的，他們也并不知道“閱兵”的借口，甚至其中許多人等到信長死亡，還搞不清內中真相。最先攻入本能寺的士兵之一、本城揔右衛門有介在回憶錄中說：“那時，太合公(即羽柴秀吉)正在備中與輝元殿下對峙，明智率軍馳援，本以為是前往山崎方向，不料卻命令進京。因為那時家康公也到了京都，我等都認為這是針對家康公的。”

士兵們認為是信長想要消滅德川家康勢力，因此派明智光秀趁夜秘密進軍前往京都。這可見即便最下層的兵卒，對于他們的領袖織田信長都報有一種怎樣的觀感--信長公是強大的君主，但他毫無信義，誅殺甚至謀殺盟友，對他來說并非不可理解之事。《耶穌會日本年報》中也說：“……命令把火繩都點了火，銃都上了扳機，長槍也整備好。部下疑惑這是打算做什么，有人認為明智受信長的命令，去殺信長的義弟三河之王(指家康)”。其實當時家康已經去往了堺，而并不在京都。

據說明智軍總兵力為一萬三千人，分為三隊：光秀本隊自保津翻山，經水尾天皇陵至嵯峨野，在衣笠山麓的地藏院布陣;一隊由明智秀滿等率領，由山陰道經過老之坂，渡過桂川;另一隊由明智光忠率領，從王子村取道唐柜岳，前往松尾的山田村。一方面，萬余大軍如果不分散行動，蹤跡是不可能不被發現的，另方面，這說明光秀的目的并不僅僅在殺死信長一人，他還要趁此機會盡快控制京都和附近地區。

明智本隊進入山城國，在沓掛宿稍作休息時，光秀命令部將天野源右衛門領一隊人馬為先驅，將此地到本能寺路上有可能泄露本軍行蹤的行人全部捉拿或誅殺。天野源右衛門果然在京都七條口附近殺死了早起種瓜的二、三十個農民。

明智大軍進至桂川時，光秀終于下達了詳細的命令：“都去掉馬蹄上包裹的東西，士卒脫掉草鞋，換上足半，鐵炮手把火繩切成一尺五寸長，并將兩端都點燃。隨時準備戰斗！”渡過桂川后，他鼓舞士兵說：“從今日起，光秀殿下即將成為天下人，即便如提鞋的低賤之輩亦當歡欣踴躍，竭盡忠勇。吾輩士卒有兩處目標(指信長下榻的本能寺，和信忠下榻的妙覺寺)，樹立武勛便在今日。有什么愿望現在盡可以說出來。有兄弟子嗣之人自不必擔心無人繼承家業，無兄弟子嗣之輩盡可從自己的親屬中選出關系親近者繼承家業。眾人封賞之高下，全系盡忠之深淺！”然后一指遠方：“前進，敵在本能寺！”